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    胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤，發病率在世界范圍內的惡性腫瘤中占第二位，其發病機制目前并不十分清楚。大多數學者認為，胃癌的發生是物理、化學、生物等多因素、多階段的發展過程。1990年Burke等首次報道了1例EBV陽性胃癌，自此EBV感染與胃癌的關系受到關注。EBV最初是由Epstein和Barr從非洲伯基特淋巴瘤（BL）培養中發現的，它與多種人類腫瘤有關。目前，對EBV相關胃癌的研究主要在臨床病理方面，而EBV感染后胃上皮細胞變化的分子機制尚不明確。筆者采用EBV感染和PAR-2基因轉染體外培養的胃上皮細胞系GES-1,對比分析細胞生物學特性的變化，從而探討PAR-2基因在EBV致胃癌發生發展中的作用。

    1.材料與方法

    1.1主要試劑

    脂質體Lipofect AMINETM 2000 regent,G418購自Invitrogen公司；小量質粒提取試劑盒、限制性內切酶、XDNA/Hind m maker，200 by DNA stepladder、瓊脂糖購自華美生物技術工程公司；RPMI1640培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清（FCS）購自基因公司；免疫細胞化學染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；胃癌病人血清為來自本院腫瘤科；載體和細胞株：pcDNA3空載體質粒、pcDNA3-c-myC重組質粒及攜帶NEW基因的重組EBV產生細胞系Akata 1061均為廣州安必平生物科技有限公司提供；人胃上皮細胞系GFS-1由南方醫科大學腫瘤研究所提供；大腸桿菌HB 101由安必平生物科技有限公司提供。

    1.2 細胞的培養

    人胃上皮細胞系GES-1用含10%FCS,100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的RPMI 1640培養基，置于37℃，5% CO2培養箱中培養。細胞2~3天換1次液，細胞融合約達80%時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。Akata細胞為懸浮生長的淋巴細胞，具有G418抗性。常規懸浮細胞培養方法，另含700mg/L G418。

    1.3 pcDNA3-PAR-2重組質粒及pcDNA3空載體質粒的獲得

    取感受態的大腸桿菌，按質粒小量提取方法進行質粒DNA的提取和純化，用BamHI酶切后電泳鑒定，用Quantity one圖像分析軟件進行灰度測定，計算提取質粒的濃度，并根據此濃度確定轉染所需的量。

    1.4 基因轉染及陽性克隆篩選

    將pcDNA3-c-myc重組質粒及pcDNA3空載體質粒按1：2~1：3的量用脂質體法分別轉染24孔板中90%~93%融合的GES-1細胞，按試劑盒操作手冊進行。37℃轉染5h后，加人FCS至終濃度10%。48h后用有限稀釋法進行陽性克隆，并置于含300mg/L G418（根據預實驗結果而定）的選擇培養基中，篩選培養2周，待抗性單克隆長至足夠大，挑取單克隆集落，擴大培養，制備細胞片。EBV感染及陽性克隆篩選：感染前3天，Akata1061細胞稀釋至2×103/ml，加入終濃度為0.5%山羊抗人降解血清，于37℃培養2h，不時輕輕搖動，然后以PBS洗2次，以含10 % FCS的RPMI 1640培養基繼續培養。感染前1天，將GES-1細胞以2mmol/LEIYI'A/PBS消化下來，置于12孔培養板中，每孔2ml培養基，含5×103細胞。轉染當天更換等體積培養基。轉染時每孔加人1ml Akata細胞懸液，于37℃，5%CO2培養箱中共同培養3天。在第2天更新一半培養基，使FCS濃度降至5%。此過程結束后，以PBS洗4次，加人2 ml含10% FCS的培養基。感染后第5天，將細胞消化下來，稀釋至2×102/ml，接種于96孔板中培養至克隆形成。此過程中，培養基中加入終濃度為300mmol/L的G418和終濃度為1mmol/L的更昔洛韋（僅第1周）。將所獲得的細胞克隆常規培養并制備細胞片。

    1.5 EBNAl及PAR-2蛋白的檢測

    將EBV感染細胞片用FTIC標記的免疫細胞化學方法檢測EBNAI的表達；感染和轉染細胞片檢測PAR-2蛋白的表達。免疫細胞化學檢測方法按說明書操作，以PBS代替一抗作為陰性對照，以細胞內出現明確亮綠色判定為陽性結果。

    1.6 細胞生長曲線測定

    取EBV感染、c-myc基因轉染及對照細胞培養至對數生長期，用0.25%胰酶消化制成單細胞懸液，經計數后以3×103個/孔接種于24孔板，每孔加人無血清培養基2ml培養1天使細胞同步化，換入含10% FCS的RPMI 1640培養基2ml繼續培養。每天取4孔進行細胞計數，每孔重復計數3次，取其平均值，連續計數7天，以時間為橫坐標，細胞數為縱坐標繪制細胞生長曲線。

    1.7 軟瓊脂克隆形成試驗

    在6孔細胞培養板中，每孔先加入0.66%底層瓊脂3ml（1.5ml 1.3%瓊脂冷卻至55℃左右，與1.5ml預溫的37℃含2×RPMI1640培養基混勻），待凝固后，加入0.33%的含細胞的上層瓊脂3ml，每組細胞均做復孔。置濕盒，在37℃，5% CO2及飽和濕度環境下培養2~3周，觀察軟瓊脂中細胞集落的形成。

    1.8 細胞周期的測定

    分別收集各組細胞，經0.25%胰酶消化，離心收集細胞，冷PBS洗滌2次。加入預冷的70%酒精，4℃固定過夜。800~1000×g離心棄上清，冷PBS離心洗滌2次并重懸，制成單細胞懸液，注意離心速度不宜過快。等體積細胞懸液和碘化丙啶（ PI）染液混合，4℃放置20min×300目尼龍過濾，加樣入流式細胞分析儀樣品室，進行細胞周期檢測。

    1.9 統計學處理

    采用SPSS13.0統計分析軟件對數據進行單因素方差分析。設定P<0.05為差異有顯著性。

    2.結果

    2.1 PWNA3-PAR-2重組質粒的鑒定

    擴增純化的pcDNA3- PAR-2重組質粒經BamHⅠ酶切、電泳，可見PAR-2基因大小為1.3kb，pcDNA3載體為5.4kb，恰好在pcDNA3的BamHⅠ位點，與所提供的質粒圖譜相符（圖1）和PAR-2蛋白表達，轉染了PAR-2基因的GES-1細胞有PAR-2蛋白表達，細胞均被染成亮綠色，陽性結果主要出現在細胞核，部分在細胞質，而空載體轉染組及正常GES-1細胞均為陰性（圖2、圖3）。

    2.2 細胞形態學變化

    正常的GES-1細胞呈短梭形，大小較為一致，核較小呈圓形或橢圓形；感染及轉染組細胞體積變大，呈橢圓形或多角形，核變大，核漿比增大，折光性增強，與正常GES-1細胞相比較，細胞增殖迅速，細胞生長的接觸性抑制不明顯，出現“成瘤性”生長（圖4）。

    2.3 免疫組織化學染色結果

    FlTC標記免疫細胞化學染色顯示，感染了EBV的GES-1細胞有EBNA1。

    2.4 細胞生長曲線測定

    細胞生長曲線如圖3，可見EBV感染細胞及c-myc基因轉染細胞數量均顯著高于空載體轉染細胞，并隨培養時間增加，這一差異越來越明顯；空載體轉染細胞數與正常GES-1細胞相比差異無顯著性（圖3）。

    2.5 細胞周期測定

    經流式細胞儀進行細胞周期分析發現，EBV感染和c-myc基因轉染細胞S期細胞比例[（70.%±0. 91%）和（67%±3 .06%）]顯著高于pcDNA3轉染對照細胞（34.74%±1.03%），差異有顯著性（P<0.05）。而EBV感染與PAR-2基因轉染細胞之間，以及pcDNA3轉染細胞與正常GES-1細胞（49.35 %±1.16%）之間差異無顯著性。

    3.討論

    EBV是人類皰疹病毒N型，屬DNA腫瘤病毒，EBV在人群中廣泛存在，多數人幼兒期就感染EBV,且終生攜帶。EBV與BL、鼻咽癌（NPC）的關系最為明確，近年來EBV在上皮源性腫瘤發生、發展中的作用備受關注。1990年等Burke首次報道了1例EBV陽性胃癌以來，EBV感染與胃癌的關系受到關注。c-myc原癌基因在多種人類腫瘤細胞中均有擴增和高表達。有研究表明，在EBV相關的多種腫瘤如BL、NPC中都存在。my基因高表達，而PAR-2基因過度表達可以改變細胞內基因調控，引起其他癌基因的活化或抑癌基因的失活，使細胞易于轉化為惡性表型，從而啟動或加速腫瘤發生。在對人鼻咽上皮細胞的研究中發現，c- my基因表達增高能激活端粒酶活性，從而誘發腫瘤。有報道EBV陽性胃癌表達EBNA 1、BARFO、BARE 1和EBERs，將BARE 1基因導入非致瘤性louckes淋巴細胞中可活化PAR-2原癌基因。

    另外，臨床病理學研究發現患有PAR-2產物陽性浸潤性胃癌的病人預后明顯差于PAR-2產物陰性腫瘤的病人。因此推測PAR-2基因在EBV相關胃癌的形成過程中起到一定的作用。實驗中用的GES-1細胞為SV40感染原代培養的胎兒正常胃黏膜上皮細胞建立的細胞系，染色體為近三倍體（50~60之間）。除了轉化特性之外，GES-1細胞基本保留了正常的細胞骨架結構，角蛋白反應陽性，接種在裸鼠中6個月觀察無致瘤性，此細胞系為研究胃上皮細胞癌變提供重要的模式系統。Akata細胞來源于EBV陽性BL病人，通過同源重組插入一個新霉素抗性基因（Neo），因此具有G418抗性。經抗免疫球蛋白處理后，能產生大量重組EBV（每個細胞含EBV質粒20個拷貝）。Akata細胞適合重組EBV克隆繁殖，是探測EBV遺傳學的有效工具，使EBV作為基因治療的載體成為可能。

    本實驗中，感染上皮細胞前，Akata細胞以0.5%山羊抗人降解血清預處理，目的即是產生大量重組EBV。由于Akata細胞中含另一個藥物敏感基因（大T基因），因此培養基中加人1pmol的更昔洛韋后，Akata細胞被除去。用Imai等創立的密切接觸法使人胃上皮細胞系GES-1感染重組EBV，用堿裂解法獲得質粒，經過酶切鑒定后采用脂質體介導法將PAR-2基因轉入GES-1細胞，以pcDNA3空載體質粒轉染同一細胞為對照，由于pcDNA3攜帶GADPH基因，因此也具有G418抗性。經過G418篩選得到EBV感染和PAR-2基因轉染的陽性克隆。對感染和轉染細胞進行鑒定，用熒光（ME）和辣根過氧化物酶（HIiP）兩種標記方法，細胞均被染成亮綠色或棕褐色，說明感染和轉染獲得成功，細胞均為陽性克隆。

    本實驗中，用細胞計數和Mil兩種方法測定細胞生長曲線，結果均顯示從第3天開始EBV感染組與c-myc基因轉染組細胞生長速度與對照組相比明顯加快，并且隨著培養時間的延長，這一差距越來越明顯，到第7天EBV感染組細胞達到3.85×105個，幾乎為對照組細胞數量的2倍，PAR-2基因轉染組細胞數為3.14×105個，與感染組相比差異無顯著性。細胞周期測定顯示感染與轉染組細胞S期細胞數目增多，兩組之間差異無顯著性，說明處于增殖期的細胞較多，此結果與細胞生長曲線結果相一致。經過熒光染色發現EBV感染細胞中有c-myc基因表達，提示EBV感染上皮細胞后可能通過某種方式上調PAR-2基因，引起其他癌基因變化，進一步影響細胞周期，使細胞增殖加快，從而使細胞發生永生化。實驗中EBV感染的GES-1細胞發生明顯形態學改變，由原來的短梭形變得更為飽滿，細胞及細胞核體積明顯增大，核漿比增大，細胞增殖迅速，細胞生長的接觸性抑制不明顯，說明EBV感染的細胞已經具有腫瘤細胞的某些特性。正常細胞生長依賴錨泊，有密度依賴抑制或接觸抑制，腫瘤細胞則缺乏這種生長限制，甚至可在半固體瓊脂中成懸浮生長，不需要依附固定表面，不受密度限制，可持續分裂堆積生長。軟瓊脂集落形成試驗是測定細胞成瘤性的一種有效方法。單細胞在體外持續增殖6代以上所組成的細胞群體，稱為集落或克隆，可含有50個以上的細胞，大小在0.3~1.0mm之間。通過計數集落形成率，可對細胞的增殖潛力做定量分析。

    本實驗中軟瓊脂中未見有細胞集落形成，提示EBV感染雖然可使胃上皮細胞增殖加快，但尚未轉化為腫瘤細胞，即胃上皮細胞尚未發生癌變。究其原因，可能是因為實驗中EBV感染上皮細胞的時間相對較短，而EBV相關胃癌的發生可能與EBV的長期潛伏有關。另外，腫瘤發生過程中癌基因與抑癌基因的相互作用也是一個漫長的發展過程。這種增殖加快的上皮細胞是否屬于癌前病變的細胞，有待進一步研究。

    綜上所述，EBV相關胃癌的發生及發展過程是十分復雜的。EBV感染胃上皮細胞后，表達諸如BARF1之類的病毒基因，通過這些基因產物激活c-myc、PAR-2基因等癌基因及一系列抑癌基因，進而影響細胞周期，細胞增殖加快，再在某些因素的影響下轉變為腫瘤細胞。因此，PAR-2基因基因可能是EBV陽性胃癌發生發展過程中的關鍵介導基因。（Chinese Journal of Current Clinical Medicine劉換新，陳娟，劉梅，葉春）