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    傳統觀念認為膿毒癥（sepsis）是一種失控的、持久性全身炎癥反應。目前，人們漸漸認識到，在膿毒癥的發病過程中機體并非處于一成不變的免疫激活狀態，負向調控（negative regulation）機制在膿毒癥的發生與發展中也發揮著重要作用。機體在免疫應答正常或沒有外界急性損害的情況下，正向與負向調控處于平衡狀態并維持各項生命活動的正常運行。但嚴重創傷、休克及膿毒癥時機體不僅出現過度的炎癥反應，而且存在著嚴重細胞免疫功能低下，表現為淋巴細胞大量凋亡和免疫無反應性，這與免疫負向調控效應密切相關[1, 2]。機體免疫功能障礙的原因是多方面的，不論是抑制性免疫細胞、細胞因子還是信號轉導通路的變化均系負向調控發揮作用的重要途徑，深入了解負向調控在膿毒癥中的作用及意義，在關鍵環節進行精確干預將有助于恢復機體正常的免疫應答狀態、防止嚴重感染并發癥的發生與發展。

    1 中樞神經系統調控外周免疫反應的負向神經信號途徑

    中樞神經系統調控外周免疫反應的神經信號通路主要包括下丘腦-垂體-腎上腺軸、交感神經系統和副交感神經系統等。當機體受到感染等外來打擊時，可迅速產生應激，調動機體內部各系統發生變化，以維護內環境的穩態，確保生長、再生與修復等基本生理功能正常。其中下丘腦-垂體-腎上腺軸及交感神經系統是機體應激反應中重要的“指揮者”與“執行者”；與此同時，副交感神經系統的植物神經功能受到抑制。我們初步的研究發現，神經內分泌激素對創（燒）傷后免疫功能及感染的反應性具有重要調節作用。嚴重創傷、燒傷和感染病理過程中，自主神經系統以及下丘腦-垂體-腎上腺軸的激活使應激激素濃度增加，造成免疫麻痹、高代謝和心血管功能異常等；如不及時糾正，會出現惡病質和進行性器官功能障礙，甚至死亡。由此可見，神經-內分泌-免疫系統功能失調是膿毒癥常見的病理生理反應，弄清其確切發病機制無疑具有重要臨床意義。新近的臨床觀察表明，針對神經-內分泌-免疫功能失調致病環節進行有效干預，可能是防止嚴重膿毒癥及多器官功能障礙綜合征（MODS）的根本途徑之一[3]。

    既往許多研究主要關注下丘腦-垂體-腎上腺軸和交感神經系統對外周炎癥免疫的調控，但有資料提示β腎上腺素能阻斷劑并不能完全調節外周自主神經系統平衡，故對神經系統負向調控的研究日益受到重視，尤其是副交感神經通路（主要通過迷走神經）。迷走神經是自主神經系統的周圍部分之一，其節前神經元位于腦干及脊髓灰質內，節后神經元分散在效應器附近，節前后纖維均為膽堿能神經纖維（包括傳入和傳出纖維），迷走神經的主要遞質是乙酰膽堿。據報道，神經系統通過迷走神經能夠顯著、快速地抑制巨噬細胞腫瘤壞死因子（TNF）-α和高遷移率族蛋白B1（high mobility group box-1 protein, HMGB1）的釋放，減輕全身性炎癥反應。這一生理機制稱作“膽堿能抗炎通路”，通過抑制促炎細胞因子的合成反饋地監控和調節炎癥過程，該效應主要依賴于細胞上煙堿型乙酰膽堿受體α7亞單位（α7 nicotinic acetylcholine receptor, α7 nAChR） [4]。研究證實，α7 nAChR廣泛表達于炎性細胞和免疫細胞，包括T淋巴細胞、樹突狀細胞（DC）等；我們新近發現，CD4+CD25+調節性T細胞（Treg）表面也存在此受體，適當濃度煙堿刺激Treg可上調其主要表面分子T淋巴細胞毒性相關抗原（CTLA）-4和叉頭翼狀螺旋轉錄因子（Foxp3）表達，最終增強Treg介導的T淋巴細胞免疫抑制活性；而α7 nAChR特異性拮抗劑能逆轉煙堿的上述效應，表明α7 nAChR是介導Treg抑制效應的受體之一[5]。此外，膽堿能抗炎通路可通過阻止T淋巴細胞的分化和成熟、抑制中性粒細胞及單核細胞的殺傷功能發揮免疫調節效應。與已經確認的體液調節途徑相比，膽堿能炎癥反射調節途徑具有快速、局部化和綜合性的特點。迷走神經傳出信號為神經調節免疫反應提供了直接通路，同時展示了新的概念：神經-免疫軸通過神經調節免疫應答，進而控制炎癥反應，自主神經系統在大腦與免疫系統之間的雙向通訊中發揮了中樞監控免疫狀態、控制炎癥反應的作用[6]。

    2 膿毒癥病理過程中外周細胞免疫反應的負向調控作用

    在機體的負向調控途徑中，不同免疫細胞亞群發揮著重要調節作用，其中Treg日益受到高度關注。Treg作為一類具有免疫調節功能的成熟T細胞亞群，不僅在免疫自穩、移植耐受、腫瘤免疫、過敏反應等方面具有重要意義，而且在感染免疫方面也可通過對細胞免疫抑制發揮核心調節作用[7, 8]。Treg的種類較多，一般依據其發育、特異性及作用機制多分為天然Treg和獲得性Treg。天然Treg主要由胸腺發育成熟后進入外周淋巴組織，目前了解較多的是CD4+CD25+ Treg；獲得性Treg是成熟T細胞（CD4+CD25- T細胞）在外周淋巴組織中接觸特異性抗原或在免疫抑制因子如白介素（IL）-10、轉化生長因子（TGF）-β的作用下活化而誘導產生。業已明確，Treg的免疫調節表現為免疫抑制性與免疫無能性，其對效應性T細胞的抑制反應主要通過細胞接觸機制和細胞因子分泌方式起作用。Treg抑制機制的發揮涉及多個膜表面分子、細胞因子和其他可溶性因子的作用，其中TGF-β與IL-10作為主要抑制性細胞因子可介導其抑制功能的發揮，Foxp3則特異地表達于CD4+CD25+ Treg，其基因改變所致轉錄因子的功能異常直接影響Treg表型及活性的發揮。此外，IL-35是一種最近新發現的抑制性細胞因子，它可由CD4+CD25+ Treg特異性產生，是Treg發揮抑制作用所必須的細胞因子[9]。

    我們的資料證實，嚴重燙傷可使大鼠脾臟CD4+CD25+ Treg表面分子CTLA-4和Foxp3表達明顯增強，并促進其免疫抑制功能成熟。與此同時，燙傷后脾組織CD4+CD25+ Treg分泌IL-10水平與假燙傷組比較也顯著升高[10]。臨床試驗結果顯示，燒傷后并發膿毒癥患者Treg表面CTLA-4及Foxp3表達顯著高于無膿毒癥患者，膿毒癥死亡組其表達亦顯著高于存活組。由此可見，嚴重燒傷可促進外周血CD4+CD25+ Treg免疫抑制功能成熟，并刺激其分泌大量抑制性細胞因子發揮負向調節作用，從而導致機體細胞免疫功能低下甚至免疫紊亂的發生[10, 11]。那么是什么因素促進了嚴重損傷后CD4+CD25+ Treg免疫抑制功能成熟呢？我們初步實驗提示，HMGB1可作為一種免疫調節因子，在外周參與調控Treg和T淋巴細胞免疫功能狀態。實驗結果表明：燙傷后HMGB1的持續升高可刺激Treg向成熟發展，從而介導T淋巴細胞增殖反應低下，并向輔助性T細胞（Th） 2漂移，免疫功能受抑；HMGB1介導的Treg功能成熟還可通過下調T淋巴細胞核因子（NF）-κB活性而減少IL-2基因表達和蛋白合成，進而影響T淋巴細胞的增殖反應活性[10]。在此基礎上，我們觀察了HMGB1攻擊后不同基因型小鼠CD4+CD25+ Treg免疫功能的改變及其受體作用機制。給C3H/HeN和C3H/HeJ [分別為Toll樣受體4野生型（TLR4+/+）和天然突變型（TLR4-/-）] 小鼠腹腔注射不同劑量HMGB1，發現C3H/HeN小鼠CD4+CD25+ Treg表達CTLA-4水平顯著下降，同時生成IL-10量也明顯降低；但不同劑量HMGB1攻擊可引起C3H/HeJ小鼠CD4+CD25+ Treg表達CTLA-4明顯上調和生成IL-10量增加。提示TLR4在HMGB1誘導CD4+CD25+ Treg免疫活性過程中發揮了重要負向調控作用[12]。

    3 膿毒癥時參與免疫負向調節的新蛋白分子

    在急性損傷或膿毒癥過程中，一些免疫負調控分子發揮著重要作用。TNF-α誘導蛋白-8樣分子2 （tumor necrosis factor-α induced protein 8 like-2, TIPE2） 是一個新發現的蛋白分子，主要選擇性表達于淋巴源性和髓源性細胞。TIPE2是維持宿主免疫穩態所必需的，主要通過對T細胞受體和Toll樣受體（TLRs）信號途徑實行負向調控，進而調節機體天然/獲得性免疫應答過程[13, 14]。有資料證實，小鼠TIPE2基因主要表達于胸腺、脾臟、淋巴結以及小腸粘膜等免疫器官或組織中，而在肝臟、心臟、肌肉、睪丸以及正常鼠的神經系統均無表達，但在實驗性自身免疫腦脊髓炎動物模型呈高表達。而TIPE2基因敲除小鼠體內細胞免疫應答反應嚴重受損，TIPE2基因缺失的T細胞培養上清Th1型細胞因子干擾素（IFN）-γ、Th2型細胞因子IL-4均呈不同程度的增加。進一步觀察證實，TIPE2與前凋亡caspase-8存在聯系，可能通過前凋亡酶調節NF-κB通路。TIPE2能下調激活蛋白-1和 NF-κB的活化，TIPE2基因缺陷細胞呈現對TLR和T細胞受體信號活化的高反應性。此外，與正常野生型相比，TIPE2基因敲除動物出現明顯膿毒性休克反應，TIPE2基因表達下調引起持續性淋巴細胞活化，可導致Fas表達增強并促進淋巴細胞凋亡[13]。

    我們采用共聚焦熒光法對CD4+CD25+ Treg細胞內TIPE2的分布進行初步定位，并從基因和蛋白水平檢測到Treg 細胞內TIPE2表達。結果顯示，CD4+CD25+ Treg細胞胞漿中高表達TIPE2，蛋白印跡證實Treg細胞中存在清晰的TIPE2條帶，同時檢測到147 bp大小的特異性TIPE2目的基因條帶。證明TIPE2在小鼠CD4+CD25+ Treg細胞內存在表達。通過采用小RNA干擾技術（siRNA）沉默TIPE2表達，我們進一步分析TIPE2對CD4+CD25+ Treg免疫抑制活性的影響，觀察到刺激活化的CD4+CD25+ Treg細胞CTLA-4和Foxp3表達明顯下降，同時IL-10和TGF-β生成量顯著減少；此外，CD4+CD25+ Treg對效應T細胞的抑制功能明顯減弱。說明TIPE2作為一種重要的負向調控分子，在CD4+CD25+ Treg細胞中表達并影響CD4+CD25+ Treg的免疫抑制功能[15]。

    4 研究展望

    綜上所述，負向調節途徑在膿毒癥復雜的炎癥免疫調控網絡中具有重要作用及意義。目前，膿毒癥確切發病機制、早期診斷與防止策略仍然是現代創（燒）傷外科和危重病醫學亟待解決的重大難題。對創（燒）傷后機體免疫功能平衡狀況與動態變化的了解尚缺乏客觀準確的指標和評估體系，中樞和外周器官中免疫負向調節細胞、受體、分子及其信號通路改變能否為膿毒癥的早期識別、病程監測、預后評估提供有價值信息尚有待進一步探討。負向調控途徑在膿毒癥免疫功能紊亂中的確切臨床意義如何？對疾病的轉歸發揮怎樣的調節效應？通過何種途徑實現對機體免疫反應的平衡調節等諸多關鍵問題均有待深入研究。